自助法
聚合酶鏈式反應(PCR)的條件如下:
1次循環(94度5分鐘)
35次循環(94度30秒，60度30秒，72度30秒)
1次循環(72度5分鐘)
將PCR擴增產物克隆入Pgem-T載體(Promega公司)，用韓國免疫調節研究中心的自動DNA序列分析儀(美國應用生物系統公司)進行序列分析。根據染料鏈終止子的反應步驟和序列分析結果，設計逆轉錄引物和重疊引物。每個核酸在主要衣殼蛋白(MCP)基因中的位置在每個DNA鏈上至少確定兩次。用BLAST軟件將DNA和推導的氨基酸序列與GenBank/EMBL數據庫進行比較。使用“CLUSTAL W”軟件進行序列分析[23]，然後使用“Treeview”[20]軟件構建系統進化樹。通過鄰接法[22]確定種間關系，通過重復1000次“Felsentein”自助法[6]推導出“NJ樹”的可靠性。